（1）50×TAEBuffer()：调节pH值至8.5，定容至1L，室温保存。
（2）LB液体培养基（800mL）：称量8g氯化钠，4g酵母提取物和8g胰蛋白胨，加入去离子水，定容至800mL，高温高压蒸汽灭菌30分钟，置于4℃冰箱保存。
（3）抗生素Ampicillin：称量1g的Ampicillin粉末，加入一定量的灭菌超纯水，充分混匀溶解，定容至10mL，然后在超净台工作，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存。
（4）IPTG诱导剂：称量1g的IPTG粉末，加入一定量已灭菌的超纯水，充分混匀溶解，定容至10mL，然后在超净台工作，用0.22μm过滤器过滤除菌，分装，-20℃冰箱保存备用。
（5）PBS缓冲溶液：分别称量氯化钾0.2g，磷酸二氢钾0.2g，磷酸氢二钠2.08g，氯化钠8.0g，加入一定量的超纯水，使其充分搅拌溶解，定容至1L，高温高压蒸汽灭菌30分钟。
（6）Columnbuffer：20mL1M的Tris-HCl，11.7gNaCl，2的EDTA，用超纯水定容至1L。
（7）Elutionbuffer：10mM麦芽糖加入到Columnbuffer中。
（8）考马斯亮蓝R-250染色液：称量0.5g考马斯亮蓝R-250粉末并放置于烧杯中，添加250mL的异丙醇。
（9）5×Tris-甘氨酸缓冲液：称取，SDS5g，甘氨酸93.825g，溶于800mL超纯水中，定容至1L，实验前用超纯水将其稀释成1×备用。
（10）1.5mol/LTris（）1.3mL，10%，10%过硫酸铵0.02mL，，上下颠倒充分混匀。
原核表达重组质粒的构建（1）利用生物软件设计PCR引物，并分别在上游引物5'端和下游引物3'端加酶切位点和pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3和pMal-c2X-NAP-S4的基因PCR扩增所用引物见表。
以本实验室保存的重组质粒pET-24b-NAP为模板，分别按照常规PCR条件扩增NAP基因及S1、S2、S3、S4基因。在冰上配制PCR体系，混合均匀，离心，然后进行PCR操作。
在每个扩增的目的基因片段反应液中，取出5μL的PCR扩增产物，同时利用DNA产物纯化试剂盒对PCR反应扩增得到的产物进行产物纯化。
PCR扩增产物经过1%的琼脂糖凝胶电泳，验证后纯化PCR扩增产物。根据PCR产物纯化试剂盒将PCR产物纯化。利用PCR，采用目的基因NAP的上游引物及S1、S2、S3、S4的下游引物，以纯化的产物为模板。
将PCR产物进行凝胶电泳检测，对目的条带进行割胶回收，使用胶回收试剂盒胶回收NAP-S1、NAP-S2、NAP-S3、NAP-S4基因PCR产物。
培养：加入700μL的LB液体培养基（已预热至42℃），37℃、200rpm，振荡培养50分钟。涂布：3000rpm、3分钟离心浓缩菌体，弃上清至剩余液体200μL，重悬混匀，将其菌液均匀涂布于含Amp的LB平板上，37℃培养箱倒置培养16小时。
第二天，观察平板上的克隆情况，平板置于4℃冰箱保存。接种环挑取单菌落到加入3mL含有Amp的LB液体培养基的5mLEP管中，将其置于37℃的摇床上，转速150rpm，震荡培养6h，进行菌落PCR验证。PCR反应完成后用1％的琼脂糖凝胶电泳检测，选取有特异性条带的单菌落菌液进行后续验证。
选取菌落PCR验证正确的单菌落菌液，取70μL加入7mL含有Amp的LB液体培养基中，置于摇床中振荡培养过夜。按照说明书步骤，提质粒进行双酶切。双酶切体系置于37℃水浴锅中酶切3-6h，酶切完成后用1%的琼脂糖凝胶电泳验证。
参考Axygen质粒小提试剂盒说明书，提取空质粒pMal-c2X。
①提前一晚，挑取单克隆，添加千分之一Amp，在LB液体培养基中进行摇菌培养，37℃，200rpm，14h。
②移液枪共吸取5mL的菌液进行离心收集菌体，12000×g，1分钟，离心后弃上清。
③取置于4℃的试剂S1250μL，重悬菌体，吹打均匀，使其无块状菌体。
④加入试剂盒中试剂S2300μL，轻轻上下颠倒6-8次，裂解菌体3分钟。
⑤加入350μL的试剂盒中试剂S3，轻轻上下颠倒数次，然后离心12000×g，10分钟。
⑥小心吸取上清，转移至SpinColumn中，套入至2mL的离心管，离心12000×g，1分钟，弃滤液。
⑦移液枪吸取500μL的试剂W1加入SpinColumn内，12000×g，1分钟离心，弃去滤液。
⑧移液枪吸取700μL的试剂WashBufferW2加入SpinColumn内，12000×g，1分钟离心，弃去滤液。重复该步骤。
⑨12000×g，1分钟离心，然后将SpinColumn转入新的1.5mL离心管内，开盖静置5分钟，挥发乙醇，不宜时间过长，防止DNA遭到损坏。
⑩移液枪吸取40μL已经60℃预热的灭菌超纯水添加在SpinColumn滤膜中央处，室温静置2分钟，12000×g，1分钟离心洗脱。最终得到质粒，超微量核酸蛋白仪测定其质粒浓度，-20℃保存备用。
T4DNA连接酶和连接酶Buffer放置于冰上，向EP管中加入ddH2O、双酶切产物载体pMal-c2X和NAP-S1、NAP-S2、NAP-S3、NAP-S4基因，混匀，置于42℃水浴5分钟后，置于冰上，再加入T4DNA连接酶和连接酶Buffer，置于16℃条件下连接过夜。
连接后第二天进行转化，方法同上。
转化后第二天进行菌落PCR鉴定，方法同上。将鉴定正确的菌扩大培养并提质粒。
取上述步骤中提取的重组表达质粒pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3、pMal-c2X-NAP-S4进行SalI和EcoRI双酶切鉴定。将双酶切体系置于37℃水浴2h。加入2μL10×LoadingBuffer后，进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测。
将双酶切鉴定正确的pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3、pMal-c2X-NAP-S4质粒送至金唯智有限公司进行测序，使用BLAST（）比对测序结果，Chromas分析基因序列单峰图谱。
（1）将测序正确的阳性重组质粒pMal-c2X-NAP-S1、pMal-c2X-NAP-S2、pMal-c2X-NAP-S3、pMal-c2X-NAP-S4分别转化至原核表达菌株中。
（2）接种环挑取单克隆菌到含Amp的LB液体内培养，200×g，37℃过夜振荡培养。
（3）第二天以1：100比例接种于含有Amp的LB培养基，200×g，37℃进行扩大培养。利用分光光度计检测菌液OD600值。
（4）当其OD600达到0.6对数生长期，加入已配好的诱导剂IPTG进行诱导处理，使其诱导剂的终浓度为0.4mmol/L。200×g，37℃诱导培养4小时。
（5）9000×g，5min离心菌液，可溶性平衡缓冲液重悬沉淀，收集菌体，-20℃保存。
另外以（DE3）和pET24b空质粒作为阴性对照。SDS-LoadingBuffer处理样品，12%SDS-PAGE蛋白电泳分析其融合蛋白表达情况。
融合蛋白rMBP-NAP-S的表达形式与纯化分析
（1）挑取单克隆菌接种，200×g，37℃在含有Amp的LB液体培养基过夜振荡培养。
（2）第二天以1：100比例接种于含Amp的800mLLB液体培养基中，200×g，37℃进行扩大培养约3小时。当其OD600达到0.6对数生长期，加入已配好的诱导剂IPTG进行诱导处理，使其诱导剂的终浓度为0.4mmol/L。200×g，37℃诱导培养4小时。
（3）收集菌体：分装诱导表达后的菌液，离心弃上清，收集沉淀，加入适量已配好的Columnbuffer重悬菌体。
（4）超声破碎，设置超声细胞破碎仪的功率为150W，超声3秒，间歇3秒，共超声20分钟，其中每超声3分钟，冰浴2分钟，防止超声过热使蛋白变性，超声破碎完成，冻存于-20℃。
（5）表达形式分析，将超声破碎后的溶液进行低温离心，分别收集上清和沉淀，SDS-LoadingBuffer处理样品。制备10%SDS-PAGE蛋白胶，90V电泳，分析融合蛋白表达形式。
（6）用8倍柱体积的Columnbuffer平衡蛋白亲和层析柱，加入菌液上清并使其匀速流出，用12倍柱体积的Columnbuffer清洗柱子，以洗去与柱子不结合的杂蛋白。用Elutionbuffer洗脱目的蛋白，洗脱过程中使用考马斯亮蓝G-250检测蛋白含量，洗脱至考马斯亮蓝G-250溶液不变色为止。收集纯化产物，SDS-LoadingBuffer处理样品。制备10%SDS-PAGE蛋白胶，90V电泳，检测蛋白纯化结果。
融合蛋白rMBP-NAP-S透析浓缩
（1）经过SDS-PAGE鉴定正确后，将所得蛋白置于处理好的透析袋中，两端用细线系紧以防蛋白外漏，于PBS中4°C过夜透析。
（2）将变色硅胶置于微波炉中烘干使其充分干燥，把透析好的蛋白连同透析袋一起放在变色硅胶中，置于4°C密封过夜，透析结束后将蛋白转移至干净的离心管保存。
融合蛋白rMBP-NAP-S去除内毒素和浓度测定
实验具体方法参考厦门EtEraserTMHP内毒素去除试剂盒说明书和SolarbioBCA蛋白浓度检测试剂盒说明书。
（1）蛋白样品的处理。在蛋白样品上样前使用0.45μm的滤膜过滤处理蛋白溶液。
（2）活化柱子内交联的琼脂糖凝胶。组装完实验仪器后，添加试剂盒内已预冷的再生缓冲液至柱子内部进行活化，控制流速缓慢流出，每次添加5mL的缓冲液，一共三次。
（3）平衡亲和树脂。添加试剂盒内已预冷的平衡缓冲液，控制流速缓慢流出，每次添加6mL的缓冲液，一共三次。
（4）上蛋白样品。添加已预冷的蛋白溶液，控制流速缓慢流出，收集流出液。柱子使用保存液保存于4℃冰箱。
（5）配制BCA工作液和蛋白样品稀释。工作液应充分混匀，减少误差，蛋白样品取5倍和10倍进行稀释。
（6）标准品稀释作标准曲线。将标准品按照0、50、100、150、200、300、400、500ng/uL进行操作处理。
（7）孵育和读数。37℃培养箱孵育30分钟，酶标仪读取A562nm的数值，作出标准曲线从而计算得出蛋白样品的浓度。
参考文献
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