相信大部分同学进入实验室第一接触的实验就是质粒提取，虽然质粒提取实验相对简单，但是还是有很多问题需要我们提防和解决的，今天小海星就为大家简单介绍一下质粒提取实验和实验中常遇到的一些问题。
质粒是携带外源基因进入细菌中扩增或者表达的重要媒介，常用的方法有煮沸裂解法、碱提法等。而我们常用的kit是采用碱提法。
不同品牌的试剂盒具体操作步骤可能不同，但这个万变不离其宗，基础知识点还是不变的。菌体在强碱性条件下裂解，释放出包括质粒在内的核酸，蛋白等物质。pH恢复中性时，共价闭合环状质粒DNA复性快，而线性的染色体DNA复性缓慢，细菌蛋白质、破裂的细胞壁和变性的染色体DNA会相互缠绕成大型复合物，而后者被十二烷基硫酸盐包盖。
当用钾离子取代钠离子时，复合物会从溶液中有效地沉淀下来，离心除去变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒DNA。
1.未提出质粒或提取质粒得率低
1）提取质粒的甘油菌使用错误对应抗性的培养基培养
2）菌体质粒拷贝数低或无质粒，菌质粒拷贝数低往往提取的质粒含量低，某些菌体在多次转接后可能出现质粒丢失的情况
3）碱裂解时间不充分，导致裂解不彻底，菌体中质粒未全部提取
2.基因组污染或蛋白质
1）加入裂解液时摇晃剧烈及裂解时间过长，菌体基因组未与菌体蛋白质,细胞壁相互缠绕形成复合物并与十二烷基硫酸盐结合成沉淀
2）离心白色絮状物时间不充分，导致上清液并不澄清混有蛋白质
3）不要使用过多菌体，导致上清液不够澄清
3.质粒降解
1）质粒提取完成后避免反复冻融
2)质粒溶解时吹打混匀时避免吹打过力，造成机械损伤
3）最后溶解质粒时应在超净工作台避免引入核酸酶造成质粒降解
作者：海星生物
公众号：Cas9X细胞基因编辑
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